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PCR仪校准的项目有哪些?快来了解下吧

浏览次数:93发布日期:2020-07-15
   PCR仪校准的项目有哪些?快来了解下吧
  PCR仪校准是实验中一定要去做的事情,一个稳定的温度循环是成功实现PCR所必需的。其中温度控制的动、稳态特性是影响PCR扩增结果正确与否的重要因素之一, 这包括温度准确性、升降温速度、温场均匀性、大超调温度。
  PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。
  PCR仪校准的项目有以下几点:
  一、温度准确性
  温度准确性是PCR仪重要的性能指标,如温度准确性低可直接造成非特异性扩增,甚至是错误的扩增结果,造成假阳性和假阴性。
  市场上各家厂商考核基因扩增仪PCR仪性能的主要指标,一般厂家的企业指标为±0.5℃,一些性能较好的产品可以实现的温度准确度为±0.3℃。故需对PCR仪控温准确度进行测试。校准实验平均温度的计算公式为:I—参加检测的温度探头序号;n—参加检测的温度探头的数量
  二、温场均匀性
  由于PCR仪加热器加热不均匀,导致PCR仪模块上各孔存在一定温差。造成试验结果偏差。一般PCR仪边缘点的温度低于中间区域,所以均匀性为PCR仪重要的性能指标。一般厂家的企业指标规定均匀性为±0.5℃,一些性能较好的产品可以实现的温度均匀度为±0.3℃。
  校准实验时,通过选取孔板中16个特殊反应位置来测量温度,并得出孔板的温度均匀性。均匀性为各个探头在同一时刻大温度与小温度的差值。均匀度计算公式为:tmax-tmin  tmax =大温度;tmin =小温度
  三、升降温速率
  PCR仪校准中扩增产物数量的多少决定了PCR的效率。为了在短时间内获得尽可能多的产物,需要仪器在升降温段具有按照预设升降温速率快速升温和降温的能力大升温速率达15~20℃。一个完整的PCR过程,是由若干个升温→恒温→降温循环构成的。因为“变性”,“退火”和“延伸”3个阶段是必须要保证的。
  因此,只有使升降温的过程尽可能地迅速,才能缩短每个PCR循环以及整个PCR 过程所需时间。一般厂家的企业指标规定升温速率为±3℃/sec。仪器校准实验时,升温速率为温度从40℃到90℃的时间;降温速率为温度从70℃到35℃的时间。
  四、大超调温度
  当温度从一定点温度调节到另一定点温度,就会产生温度的超调。超调温度过大同样会对试验产生影响,所以校准实验时,需要计算大超调温度和平均超调温度。
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